Spektrofotometri

Laporan Praktikum Nama : An Nisa Rosiyana
Kimia Analitik NIM : G84080038
Hari/Tanggal : Jumat/21 Mei 2010
Waktu : 13.00-14.00 WIB
PJP : Wulan Tri Wayuni, S.Si
M.Si
Asisten :Wahyu

SPEKTROFOTOMETRI
PENDAHULUAN
Spektrofotometri menggunakan spektrofotometer yang pada prinsipnya terdiri dari sumber radiasi, monokromator, sel, fotosel, dan detektor. Sumber radiasi dalam spektrofotometri serapan mempunyai dua fungsi. Pertama, memberikan energi radiasi pada daerah panjang gelombang yang tepat untuk pengukuran. Kedua, mempertahankan intensitas sinar yang tetap selama pengukuran. Sebagai sumber radiasi dapat digunakan lampu hidrogen, atau deuterium, dan dapat pula lampu filamen.
Monokromator berfungsi mendapatkan dan melewatkan sinar melewatkan sinar dan melewatkan sinar monokromatis ke zat yang akan diukur. Radiasi dengan panjang gelombang pendek dibiaskan lebih jauh daripada radiasi dengan panjang gelombang yang lebih panjang. Singkatnya, semakin pendek panjang gelombang, semakin jauh suatu radiasi dibelokan. Hasil pembiasan terpecahnya radiasi menjadi beberapa radiasi dengan panjang gelombang tertentu yang semuanya tercakup dalam radiasi awal.
Setiap larutan yang berbeda mempunyai gelombang spektrum elektromagnetik yang berbeda pula. Ada bagian spektrum elektromagnetik yang utama dan penting dalam biokimia yaitu cahaya ultraviolet (UV) dan cahaya visible (VIS). Cahaya dalam bagian ini mempunyai energi yang cukup untuk mengerakkan molekul elektron valensi. Ketika foton yang ditetapkan energi yang berinteraksi dengan molekul maka satu atau dua proses tejadi. Foton akan bergerak secara acak atau akan mentransfer energinya ke molekul (Boyer 1986). Energi yang dihasilkan dalam fotosel memberikan signal pada detektor. Sinar tersebutlah yang dapat membaca besarnya serapan atau transmisi radiasi oleh zat terlarut (Staf Bagian Kimia Analitik 2007). Pada prinsipnya kerja dari spektrofotometer berhubungan dengan panjang gelombang, kecepatan cahaya, dan frekuensi (Boyer 1986).
Asam amino adalah senyawa organik yang memiliki gugus fungsional karboksil (-COOH) dan amina (biasanya –NH2). Gugus karboksil ini memberikan sifat asam dan gugus amina memberikan sifat basa. Asam amino pembentuk protein akan saling berikatan dengan ikatan peptida, sehingga dalam satu molekul dipeptida mengandung satu ikatan peptida.

Gambar 1 Struktur Lisin


Lisin adalah salah satu dari 20 alami yang paling umum asam amino yang dibutuhkan tubuh untuk pertumbuhan dan perbaikan jaringan. Lisin merupakan asam amino esensial karena tidak dapat disintesis dalam tubuh dan kerusakan adalah ireversibel. Lisin merupakan asam amino pembatas dalam semua butir serealia, namun banyak di semua pulsa. Sebuah kekurangan lisin dapat mengakibatkan kekurangan niacin (yang merupakan Vitamin B ). Pada jaringan, lisin mudah mengkonversi karbon epsilon yang kemudian menjadi karbon dioksida, membantu membentuk asam glutamat. Hal ini juga dapat dikonversi ke karnitin di dalam tubuh. Sebuah properti unik yang telah lisin adalah bahwa hal itu tidak berubah nitrogen dengan asam amino lain yang beredar Seperti semua asam amino, lisin fungsi sebagai sebuah blok bangunan untuk protein . Ini juga merupakan pemain kunci dalam produksi berbagai enzim , hormon , dan antibodi melawan penyakit. Lisin yang terlibat dalam reaksi browning, atau carmelization, dalam makanan seperti kue, donat, kue dan sereal. Lisin tergantung riboflavin , niasin , dan vitamin B6 untuk asimilasi nya. Menggunakan besi serta vitamin C , lisin membantu bentuk kolagen.

TUJUAN
Percobaan ini bertujuan mengetahui serapan suatu zat dan menentukan kandungan asam amino bebas pada kentang atau ubi jalar dengan cara spektrofotometri.

ALAT DAN BAHAN
Alat-alat yang dipakai dalam spektrofotometri adalah spektrofotometer, kuvet, labu takar 50 mL, tabung reaksi, penangas air, sentrifusa, spektronik 20, gelas piala, dan buret 50 mL.
Bahan yang digunakan adalah larutan standar pada penentuan kadar asam amino bebas, kentang, piridin 10%, ninhidrin 2 %, asam amino lisin (30-70 ppm) dan tisue.

PROSEDUR PERCOBAAN
Pembuatan larutan standar dan blanko. Analat asam amino lisin dimasukan kedalam labu takar 25 mL. Kemudian dibuat dengan konsentrasi yang berbeda-beda yaitu 0 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, dan 70 ppm. Setelah itu ambil 5 mL dan dimasukan kedalam tabung reaksi. Masing-masing dari tabung reaksi ditambahkan 0.5 mL piridin 10 % dan 0.5 ninhidrin 2%. Semua tabung reaksi dipanaskan pada air yang mendidih sampai berwarna ungu selama 20 menit. Setelah itu didinginkan dan dimasukan ke dalam labu takar 25 mL dan tambahkan akuades sampai tanda tera. Larutan blanko disiapkan dengan mengganti analat dengan air suling.
Pembuatan spekrum serapan zat. Kuvet diisi dengan salah satu larutan standar yang ditentukan pada penentuan kadar asam amino bebas. Larutan blanko disiapakan dnegan menggantikan analat dengan air suling pada penentuan asam amino bebas. Absorban larutan dihitung pada kisaran panajng gelombang 400-700 nm, dengan interval 5 nm. Setiap interval panjang diukur larutan standar dan blanko.
Analisis asam amino pada contoh. Kentang ditimbang sebanyak 0.5 g, lalu dimasukan ke dalam tabung reaksi dan tambahkan air sampai setengah tabung reaksi. Kemudian vortex selama 5 menit. Supernatan diambil dan dimasukan kedalam labu takar 25 mL. Ulangi proses diatas. Supernatan yang ada di dalam labu takar 25 mL ditepatkan sampai tanda tera dengan menambahkan air suling. Kemudian diambil 5 mL dan dimasukan kedalam tabung reaksi. Ditambahkan 0.5 mL piridin 10 % dan 0.5 ninhidrin 2% ke dalam tabung reaksi. Kemudian dipanaskan pada air mendidih sampai bewarna ungu selama 20 menit. Setelah itu didinginkan dan maskan kedalam labu takar 25 mL dan ditambahakan air suling sampai tanda tera. Kemudian diukur nilai absorbansi dengan serapan panjang gelombang tertinggi. Percobaan dilakukan sebanyak empat kali ulangan.

HASIL DAN DATA
Tabel 1 Absorbansi larutan blanko dan standar pada  = 625 nm
Standar ppm %T A
0 100 0
30 84.6 0.0726
40 70.4 0.1524
50 54.6 0.2628
60 43.4 0.3625
70 36.6 0.4365

Contoh perhitungan :
 = 625 nm
A ?
A = -log %T 
= -log 84.6/100
= 0.0726



Gambar 2 Perbandingan antara konsentrasi dan absorbansi
Tabel 2 Absorbansi sampel pada  = 625 nm
Ulangan Bobot (gr) %T A [sampel] %b/b
1 0.5095 33.8 0.4711 81.2769 3.98807
2 0.5037 31.2 0.5058 86.6154 4.2500
3 0.5051 20.0 0.6989 116.3231 2.9081
4 0.5010 36.8 0.4342 75,6 1.8900
x = 89.9538
Contoh perhitungan
 = 625 nm
A ?
A = -log %T 
= -log 33.8/100
= 0.4711 y = - 0.0572+0.0065 x
0.4711 = - 0.0572+0.0065 x
0.5283 = 0.0065x
X =81.2769


%b/b = ([sampel] x FP x V x 1 L/1000 mL x 1 g/1000 mg )/(bobot sampel) x 100%
%b/b = (81.2769 x 5 x 50 x 1 L/1000 mL x 1 g/1000 mg )/0.5095 x 100%
%b/b = 3.98807%

SD =√(((xi-x)2)/(n-1))
SD =√(((81.2769-89.9538)2 + [86.6154-89.9539]2+[116.3231-89.9539]2+[75,6-89.9539]2 )/(4-1))
SD =18.1457

Ketelitian = [1-(SD/(Rerata [sampel])) ]x 100%
Ketelitian = [1-(18.1457/89.9538) ]x 100%
Ketelitian =[1-0.2017]x 100%
Ketelitian = 79.8277%


Gambar 3 Perbandingan antara konsentrasi sampel dan absorbansi
PEMBAHASAN
Praktikum kali ini melakukan percobaan dengan teknik penggunaan spektrofotometri. Penggunaan spektrofotometri ini untuk menghitung panjang gelombang suatu sampel. Percobaan pertama dilakukan pembuatan larutan standar dan larutan blanko dengan konsentrasi 0 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, dan 70 ppm. Larutan blanko dan standar kemudian diukur nilai absorbansi. Panjang gelombang yang digunakan adalah 625 nm. Nilai absorbansi yang didapat adalah 0 A, 0.0726 A, 0.1524 A, 0.2628 A, 0.3625 A, dan 0.4365 A. Persamaan garis yang didapat adalah y = - 0.0572+0.0065 x dengan nilai r adalah 0.9556.
Ninhidrin adalah suatu reagen berguna untuk mendeteksi asam amino dan menetapkan konsentrasinya dalam larutan. Senyawa ini merupakan hidrat dari triketon siklik, dan bila bereaksi dengan asam amino menghasilkan zat berwarna ungu (Hart dkk, 2003).
Ninhidrin merupakan suatu oksidator sangat kuat yang dapat menyebabkan terjadinya dekarboksilasi oksidatif asam α-amino untuk menghasilkan CO¬¬2.NH3 dan suatu aldehid dengan satu atom karbon kurang daripada asam amino induknya (Tim Dosen Kimia, 2007).

Gambar 4 Struktur ninhidrin
Piridin sama seperti ninhidrin berfungsi sebagai pelarut dan pengikat protein sehingga dapat terjerap. Piridin ini akan membentuk komples berwarna ungu.

Gambar 5 Struktur piridin
Percobaan yang kedua mengenai pembuatan spektrum serapan zat. Panjang gelombang yang dilakukan berada antara 400-700 nm. Akan tetapi nilai absorbansi yang dipilih adalah 625 nm karena pada nilai ini merupakan nilai absorbansi yang paling tinggi daya serapnya.
Percobaan ketiga menganalisis asam amino pada contoh. Contoh yang digunakan adalah kentang. Hasil pengukuran nilai absorbansi pada panajng gelombang 625 nm didapatkan hasil 0.4711 A, 0.5058 A, 0.6989 A, dan 0.4342 A. Adapun konsentrasi sampel didapat dari persamaan larutan blanko dan larutan standar. Konsentrasi yang didapat dari setiap ulangan adalah 81.2769 ppm, 86.6154 ppm, 116.323 ppm, dan 75,6 ppm.
Perhitungan %b/b didapat dari konsentrasi sampel dikali faktor pengenceran, dan volume selanjutnya di bagi 106 dan bobot sampel masing-masing. Persen bobot per bobot yang paling tinggi adalah 4.2500% sedangkan untuk nilai terkecil adalah 1.8900%. Persamaan garis yang didapat adalah y = 0.008x + 0.506
R² = 0.008.
Standar deviasi dari percobaan 2 adalah 18.1457. Nilai ketelitian yang didapat adalah 79.8277%. Nilai ketelitian ini masih kurang karena suatu percobaan dikatakan berhasil jika nilai ketelitiannya adalah lebih dari 80%.

Gambar 6 Reaksi Ninhidrin dengan Asam Amino
Asam amino adalah padatan berbentuk kristal dengan titk didih yang cukup tinggi dan kebanyakan sangat larut dalam air. Pemanasan asam amino dalam pereaksi ninhidrin akan menghasilkan senyawa kompleks berwarna ungu. Intensitas warna ini bebanding langsung dengan konsentrasi asam amino bebas.

SIMPULAN
Hasil percobaan menunjukan bahwa setiap larutan blanko dan larutan standar semakin besar nilai konsentrasi maka nilai absorbansi semakin tinggi dengan nilai persamaan garis y = - 0.0572+0.0065 x. Dari persamaan yang telah dapat menentukan konsentrasi sampel. Hasil percobaan yang ketiga tentang analisis asam amino menyatakan bahwa yang memiliki %b/b yang paling tinggi adalah sampel yang memiliki massa 0.5037 gram dengan konsentrasi 86.6154 ppm. Adapun %b/b adalah 4.2500%. Ketelitian yang didapat kurang dari 80%.

DAFTAR PUSTAKA
Boyer RF.1986.Modern Experimental Biochemistry.United State Of Amerika: The Benjamin/ Cummings Publishing Company
Harvey D.2000.Modern Anlytical Chemistry.United State of America: The McGraw-Hill Companies, Inc
Staf Pengajar Kimia Analitik.2007.Diktat Kimia Analitik. Bogor: Bagian Kimia Analitik Departemen Kimia Fakutas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Tanti. 2009. Sifat-Sifat Bahan Kimia.(Terhubung berkala)